Dieser Artikel (Teil 1) befasst sich mit der Frage, wie Kalzium in der Milch vorliegt, beziehungsweise, wie es in den Kaseinmizellen eingebaut ist; wir beziehen uns auf das sog. »dual-binding model« von Horne. In Teil 2 wird auf die Säuerung der Milch unter besonderer Berücksichtigung der Vorgänge an und in der Kaseinmizelle eingegangen und eine Hypothese erstellt, warum eine saure Gallerte wie z. B. Frischkäse, der bekanntlich einen tieferen ph-Wert hat, noch mizellares Kalzium enthält. Über die Bestimmung von mizellaren Kalzium, die Verteilung des Kalziums in Käse und dessen möglichen Zusammenhang mit Bitterkeit wird in Teil 3 berichtet.
Frische Milch enthält etwa 30 mM Kalzium (Ca2+), wobei ein Drittel (ca. 10 mM) in der wässrigen Phase assoziiert mit verschiedenen Anionen (insbesondere Phosphate und Zitrate) aber auch als freies lon (ca. 2-3 mM) vorliegt. Die anderen Zwei Drittel (ca. 20 mM) sind in der kolloidalen (mizellaren) Phase (i.e. Kasein = CN) verteilt und sowohl direkt (ca. 5mM) an organisches Phosphat (Po) der Phosphoserinreste des αS1 -, αS2- und β-Kasein, als auch (ca. 15mM) an organisches Phosphat (Pi) gebunden. In Wechselwirkung mit der Phosphoserinreste und Karboxylgruppen der Proteine bildet das Kalzium das sogenannte kolloidale Kalziumphosphat, welches heute in der milchwissenschaftlichen Literatur als »colloidal calcium phosphate nanoclusters« (CCP) bezeichnet wird.
Kalziumgehalt entscheidend
Es ist seit langer Zeit bekannt, dass die Struktur und Textur von Milchprodukten u.a. durch den Kalziumgehalt mitbestimmt wird; dieser wiederum, ist stark von den Herstellungsbedingungen abhängig. Die Elastizität z.B. von Emmentaler oder die krümelige Textur von Grana oder Parmeggiano Reggiano wird u.a. durch die Menge an Kalzium, die die Käsemasse zur Zeit des Molkenablassens enthält bzw. den bei der Käseherstellung resultierenden ph-Wert, mit definiert. Die Käsemasse enthält demnauch unterschiedliche Mengen an löslichem und kolloidalem Kalzium. Es ist bekannt, dass mit vorschreitender Milchsäuerung bzw. Bildung von Milchsäure durch die verwendeten Säurewecker Ca2+ und Phosphat aus den »Nanoclusters« gelöst wird und in die wässrige Phase übergeht.
Vor einigen Jahren wurde von verschiedenen Forschungskreisen festgestellt, dass eine fast totale Entmineralisierung (d.h. Verlust an Ca2+ und Phosphate) der Kaseinmizellen bei einem pH um 5,0 stattfindet. Es ist dann zu erwarten, dass Frischkäse, dessen pH-Wert Kleiner als 5,0 ist, kein oder kaum mizellares Kalzium enthält.
Es wurde jedoch Kürzlich postuliert, dass das na Phosphoserin gebundene Kalzium eine wesentliche Rolle in der Bildung von sauren Gelen, wie sie im Frischkäsevorkommen, spielt (Famelart et al., 2009). Über diesen wenig erforschten Bereich der Frischkäsetecnologie wird in diesen Beitrag berichtet.
Die Kaseinmizelle
Es gibt verschiedene Modelle der Kaseinmizelle, die versuchen zu erklären, wie die Mizelle aufgebaut ist (für eine Übersicht siehe z.B. de Kruif et al., 2012; Dalgleish; Corredig, 2012; QI, 2007; Farrell et al., 2006; Phadungath, 2005). Diese Modelle sollen in der Lage sein, eine Erklärung zu Bildung und Wachstum der Mizellen zu geben. Ferner sollen diese Modelle die Interaktionen des Kaseins mit seiner Umgebung (z.B. pH) während der Verarbeitung (z.B. Erhitzung, Gelierung) beschreiben, was sich bisher als sehr schwierig erwiesen hat (Horne, 1999; Walstra, 1999; und die o.g. Referenzen).
Die CN-Mizellen haben Einen Volumenanteil von ca. 6-12% in der Milch, sie weisen eine sehr poröse Struktur auf; Daher fürhrt u.a. die freie Beweglichkeit von ß-CN bei tieferer Temperatur. Sie Kommen in verschiedener Größe vor (50 - 250nm im Durchmesser). Wir wissen heute auch, dass sie viel Wasser enthalten, wie vor Kurzem von der Arbeitsgruppe um Harte eindeutig nachgewiesen werden konnte (Trejo et al., 2011). Ihre Trockenmasse hat Einen Eiweiß-Anteil von ca. 93% und einen CCP-Anteil von ca. 7%. In dieser Arbeit werden wir Keine umfassende Revision der CN-Mizellenmodelle geben. Es gibt bisher kein allgemein akzeptiertes Model (De Kruif et al., 2012; Dalgleish, Corredig, 2012) und wir werden ins auf das Model von Horne – das sog. »dual-binding model«– beziehen, das unseres Erachtens eine plausible Anforderung an ein CN-Model erfüllt (Horne, 1998; 2009; Lucey, 2002), obwohl De Kruif et al. (2012) es thermodynamisch zum Teil in Frage stellen. Wir möchten darauf hinweisen, dass das Model von Horne (1998) eine Weiterentwicklung des Nanocluster-Models von Holt (1992) darstellt und dass letztendlich beide Modelle in etwa das gleiche repräsentieren. Basis für dieses Model ist, dass phosphorylierte CN sich mit wachsenden CCP-Nanoclusters verbinden, um zu verhindern, dass die milchbildende Zelle »verkalkt« (Niederschlag von Kalziumphosphat) (Holt, 1992; Holta; Horne, 1996; de Kruif et al., 2012; Dalgleish; Corredig, 2012; Nagy et al., 2010).
Das »dual binding« Model
In dem »dual binding« Model wird die Kaseinmizelle als ein »lebendiges« Protein dynamischer Natur beschrieben (Horne, 1998, 2006, 2009), das durch hydrophobe und elektrostatische Interaktionen fähig ist, sich selbst ständig umzuorganisieren. Dabei bildet sic hein homogenes Netzwerk von CN-Polymeren, stabilisiert durch CCP-Nanoclusters. In anderen Worte, zwei separate Bindungsarten sind für Bildung, Waschstum, Integrität und Stabilität der CN verantwortlich: Quervernetzungen in Hydrophoben Bereichen, sowie Neutralisierung und Brückenbildung von negativ geladenen Bereiche, insbesondere von Phosphoserin-Clusters (Phosphatzentren) durch mineralische CCP-Nanoclusters. Kern dieses Model ist auch, dass die nichtkovalent Attraktion im hydrophoben Bereich zwischen CN-Mizellen im Vergleich zu der elektrostatischen Repulsion für die Integrität der Mizellen (bzw. ihre Stabilität) stärker verantwortlich ist (Horne, 2009). Streng genommen, unter nicht-kovalenten, schwachen Interaktionen sind sicherlich neben hydrophoben Interaktionen auch Wasserstoff-Bindungen, Van der Waals-Kräfte und Ionen-Bindungen zu finden (de Kruif et al., 2012).
Das Horne Model (postuliert 2009):
· dass Quervernetzungen insbesondere in den hydrophoben Bereich (»Train«) der einzelnen CN entstehen.
· dass CN-Wachstum durch die (-) Ladung auf dem hydrophilen »Loop« limitiert wird und dass diese Ladung auch durch die (+) geladene CCP-Nanoclusters neutralisiert wird, die auch CN quervernetzen kann. Durch mindestens zwei bzw. drei Bindungen (zwischen funktionellen Gruppen, wie Phosphoserinreste) geht das Polymerwachstum bzw. die Verzweigung und Netzwerkbildung vonstatten.
Die individuellen Kaseintypen nehmen zu nächst bestimmte Konformationen ein, beruhend auf ihrer Aminosäuresequenz, wobei verschiedene Strukturen entstehen:
»Train-Loop-Train« in αS1-CN
» Loop-Train-Loop-Train« in αS2-CN
» Loop-Train« in β-CN- und
»Train-Loop« in κ-CN
Diese wiederum weisen schwach bis stark hydrophobe (attraktive) sowie hydrophile (repulsive) Bereiche auf. Durch Cross-Linking (Quervernetzung) in den hydrophoben Bereichen und Brückenbildung durch CCP-Nanoclusters polymerisieren die individuelle CN zu den Mizellen. Das Wachstum wird durch die »Train-Loop« Struktur des κ-CN (und durch dessen fehlenden Phosphoserin-Cluster) beendet, da sich dieses Protein über seinen hydrophoben Bereich (»Train«) mit den anderen CN verknüpfen kann (Horne, 1998, 2006, 2009). Abbildung 1 zeigt schematisch dieses Model und als Vergleich das Model von Holt.
Aus Abbildung 1 ist zu ersehen, dass die CCP-Nanocluster(▲) vor allen in Inneren der CN-Mizelle verteilt sind, wo sie eine Brückenbildungsfunktion einnehmen (die einzelnen CN »zementieren«). Darüber hinais zeigt das Model deutlich auf, dass die Anlagerung der κ-CN an der Peripherie der Mizelle das Wachstum beedet bzw. dass dessen hydrophiler »Loop« die sog. »Haare« auf der Mizelle darstellen. Letztere tragen zu der elektrosterischen / elektrostatischen Abstoßung bei pH 6,7 zwischen CN-Mizellen und zu deren Stabilität bei. McMahon & Oomen (2008) leiteten aus TEM-Abbildungen ab, dass die individuellen CN (αS1-, αS2-, β-, κ-CN) viele interaktive Bereiche haben sollen (dank ihrer Aminosäuresequenen) und sich verbinden können (z.B. αS2-CN hat vier potentielle interaktive Bereiche).
Unseres Erachtens nach untermauert diese Arbeit (McMahon & Oomen, 2008) eindeutig das Model von Horne; das gleiche gilt für andere Arbeiten (Farrel et al., 2006; Nagy et al., 2010; Trejo et al., 2011).
Abbildung 2 zeigt Cryo-Transmission Elektromikroskopie-Bilder der CN-Mizelle, worin die Pfeile auf die CCP-Nanoclusters zeigen (Marchin et al., 2007). Daraus ist ersichtlich, dass modelunabhängig (Horne oder Holt), CN CCP-Nanoclusters enthalten. Diese Nanoclusters verbinden sich erst lymerisiert wurden; dabei entsstehen Kanäle und Höhlen, die den CN Mizellen ihr poröse, wasserhaltige Struktur verleihen, Abb. 2B und 2C (Trejo et al., 2011; Bouchoux et al., 2010; Nagy et al., 2010; Marchi neta al., 2010).
Kasein-Mizellen in drei Ebenen
Kasein-Mizelle haben eine offene Struktur (Trejo et al., 2011; Farrel et al., 2006). Kürzlich wurde von Bouchoux et al. (2010) berichet, dass, wenn Druck auf die Mizelle ausgeübr wird, bestimmte Ebenen in der CN-Mizellen-Struktur den Druck aushalten und andere Ebenen kollabieren. Diese Autoren posulieren, dass sich die CN-Mizelle wie ein Schwamm verhält, mit einem hierarchischen Aufbau in drei Ebenen:
· die niedere Ebene, die CaP-Nanoclusters, in der sich die CN veranken;
· die harte Ebene (Größe 10-40 nm, ca. die Hälfte des Kaseinvolumes bei CN ca. 25gL-1), aus Bereichen, die miteinander gebunden und z.T. fusioniert sind, und die eine zusammenhängende, poröse Struktur bilden;
· die dritte Ebene ist die CN-Mizelle selbst, die aus ca. 30 harten Bereichen (in einer Mizelle mit 100nm) besteht und sehr polydispers ist.
Dieses Model steht nicht unbedingt in Widerspruch mit dem »dual binding« Model, sondern unterstützt es u.E.
Einblick in die CN-Biosynthese
Die individuellen CN werden in den Ribosomen des endoplasmatischen Retikulums (ER) der Milch bildenden Epithelial (Alveolar)-Zellen synthetisiert. Die genetische Informtion (DNA) für die Synthese liegt im Zellkerne dieser Zellen. Die Interaktionen zwischen den individuellen CN finden nach derem Transpor taus dem ER statt; anscheinend fungiert αS1-CN als Chaperon auf den Transport der anderen Proteine zu dem Golgi-Apparat, wo sie phosphoryliert und glykosliert werden. αS1-, αS2-, β- und K-CN enthalten jeweils acht, neun-elf, f¨nf und eine Phosphat-Gruppen (Farrel et al., 2006). Die Phosphorylierung ist ein wichtiger Schritt, denn sie erlaubt die Bindungwon Kalzium an die Proteine. Nach weiterem Transport aus der Golgi-Zisterne und auf dem Weg zur apikalen plasmatischen Membran der Epithelial-Zele findet in den sekretorischen Vesikeln eine weitere Organisation zur CN-Mizellen Struktur statt, Le Park et al. (2010).
[1] WOLFSCHOON-POMBO, A. F.; ANDLINGER, D. J. Kaseinmizellen, Säuerung der Milch um kolloidales Kalzium. Teil I. DMZ, v. 21, p. 31-33, 2013