Die Pufferungskurve von idealer Molke (MF-Permeat) – Teil III

Serie: Pufferung der Molkenproteine  

In Teil 1 und 2 wurde die Pufferwirkung der Zitrat-, Phosphat- und Karbonatspezies sowie die der Laktose und des Wassers im MF-Permeat beschrieben. Die Pufferungskurven von MF-Permeat und UF-Permeat wurdem im Vergleich dargestellt uns dabei die Pufferwirkung der Milchsalze graphisch um rechnerisch bei den maximalen Pufferungspeaks erklärt. Aus dem Unterschied zwischen beiden Pufferungskurven könnte mam den Beitrag der Molkenproteine graphisch errechnen. Dazu wurden publizierte Titrationskurve von β-Laktoglobulin, α-Laktalbumin und Rinderserumalbumin herangezogen, um β als f(pH) graphisch bzw. rechnerisch zu bestimmen. In Teil 3 wird auf die individuelle Pufferwirkung diese Hauptmolkenproteine im MF-Permeat eingegangen.

Zur Titration von Molkenproteinen

Akminosäuren liegen in der wässrigen Phase des MF-Permeates als Zwitterionen bzw. dipolare Ionen vor, d.h. sie können als Säure oder als Base fungieren. Die Säuretitration fügt Protonen an sämtliche protonierbare Gruppen (Seitenketten) der Molkenproteine insbesondere der Glutamin(Glu) und Asparaginsäure (Asp) sowie auch an Milchsalze zu. Wie viele [H+]-Ionen abgefangen werden könen ohne den pH-Wert merklich zu ändern, hängt von der Gesamtkonzentration der puffernden Substanzen und derem pKS-Werten ab. Seitenketten der sauren Aminosäuren der Molkenproteine sinf in ihrer deprotonierten (basischen) Form einfach negativ geladen (also bei pH Wert ~6,7) und in ihrer protonierten (sauren) Form ungeladen. Im Allgemeinen haben sieben Aminosäureseitenreste ionisierbare Gruppen in bestimmten Bereichen der pH-Skala. Bei Asp, Glu, Tyr und Cys tragen diese Gruppen eine negative Ladung über derem pKS (Dissoziationskonstant) und für His Lys und Arg tragen die ionisierbaren Gruppen eine positive Ladung unter derem pKS (Pace et al., 2009).

Die Imidazolgruppe als Seitenkette der Aminosäure Histidin besitzt einen pKs-Wert der nahe des neutralen pH-Bereiches eine significante Pufferkapazität in physiologischen Flüssigkeiten hat. Molkenproteine enthalten wenige His-Reste (siehe Tab. 4). Unter ihnen hat Rinderserumalbumin (BSA) zwar besonders viele (16 titrierbare Gruppen), aber dessen Konzentration im MF-Permeat ist sehr gering (~6 x 10-6 mol). Glu und Asp mit ihren Karboxylseitenketten sind unterschiedlich in β-Laktoglobulin verteilt (Fogolati et al., 2000). Diese Aminosäuren sind in größen Konzentrationen in den Molkenproteinen enthalten (siehe Tab. 4) und man kann annehmen, dass die Protonierung mit mehr oder weniger sterischen Hindernissen in den verschiedenen Molkenproteinen stattfindet. Zuden entsteht ein scheinbares Ionenngleichgewicht, das nicht die intrinsiche und individuelle Dissoziationskonstante (pKS) darstellt.

Fogolari et al. (2000) konnte mittels NMR die einzelnen pKS-Wert für die protonierbaren Aminosäuren des β-Laktoglobulin bestimmen. Er hat dabei festgestellt, dass die Karboxylgruppen von Asp einen pKS-Wert zwischen 3,1 – 3,9, die vom Glu bzw. 7,0, je nach Position, haben (vgl. Auch Tab. 4).

Die Werte der Dissoziationskonstanten der ionisierbaren Gruppen sind durch die Wirkung von z.B. anderen Ladungen auf die Proteinmoleküle, von der Bindung von Kationen (wie Ca2+, Mg2+) usw. beeinflusst und deswegen ist es praktisch unmöglich, in einem komplexen System wie dem MF-Permeat (oder Milch) die individuellen Pufferungskurven zu bereichnen bzw. addieren. Die breite Pufferung im pH-Bereich ~3,8 - 4,8 haben wir zu ~70% (bei pH 4,4) durch den Beitrag der gesamten Milchsalze (Abb. 7 und Tab. 3, Teil 2) erklärt. Die Molkenproteine spielen dabei auch eine sehr wichtige Rolle (Tab. 4).

Der Tabelle 4 nach findet die Dissoziation der Molkenproteine insbesondere um den pH-Werte 4 und um pH ~7 statt, in denen auch eine Pufferung (Abb. 2 und 7) auftritt. Die Titrationskurve von β-Lactoglobulin in pH Bereich 1,5 – 11,8 wurde u.a. von Nozali et al. untersucht (1959); sie bestimmten 53 titrierbare Karboxylgruppen (mit pKS von 3,75 bis 4,75), 4 Imidazolengruppen, 30 Aminogruppen (2α, 28ε) sowie sechs Phenol- und sechs Guanidingruppen per Mol Protein (Tab. 3, MG 35.500 g/mol), fogolari et al. (2000) bestimmten 52 (Asp+Glu)Karboxyl-,30 Lys-, acht Tyr-, sechs Arg, vier His- und ein CysGruppe(n) dei der Titration von β-Laktoglobulin mit NMR.

Beta-Laktoglobulin (β-Lg) existiert in Milch als Monomer (~18.363 g/mol) unter pH 3,5 und über pH 7,5 und als Dimer zwischen diesen pH-Werten. Die pKS-Werte der Karboxylgruppen befinden sich in dem pH-Werte der maximalen Pufferung des MF-Permeates, deswegen die große Wirkung um pH 4. Die Titrationskurve von den zwei genetischen Varianten von β-Lg A und B stimmen miteinander überein (Tanford & Nozaki, 1959).

Die [H+]- Titrationskurve von α-Lactalbumin im pH Bereich 2,0 – 12,0 wurde u.a. von Robbins et al. (1967) untersucht: sie bestimmten 23 titrierbare Carboxylgruppen, drei Imidazolgruppen, 13 Aminogruppen (2α, 28ε) und fünf Phenolgruppen per Mol Protein (MG 15.554 g/mol) sowie eine starke, säureinduzierte Konformationsänderung unter pH 4,0. Diese Autoren ermittelten pKS-Werte (bei 25º C) von 3,8 bis 4,38 für die verschiedene Karboxylgruppen (also im maximalen Pufferbereich der Abb. 2 und 7!) sowie 6,14 für die drei Imidazolgruppen. Im neutralen oder alkalischen Bereich (pH 6,0 - 12,0) ist die Titrationskurve perfekt reversibel.

Tanford et al. (1955) bestimmten folgende titrierbare Gruppen (und pKS-Werte) in Rinderserumalbumin (BSA) (65.000 g/mol): ein α-Carboxyl- (3,75), 99 β- und γ-Carbolxyl- (3,95), 16 Imidazol- (6,9), 1 α-Amino- (7,75), 57 ε-Amino- (9,8), 19 Phenol- (10,35), 22 Guanidin- (>12) und keine freie Sulfhydryl-Gruppen (Tab. 4). Curvale (2009) titrierte reines BSA zwischen pH 2,5 und pH 10,5 und ermittelte besonders in dem pH-Intervall 2,5 – 4,5 eine Erhöhung in der Pufferintensität mit zunehmender BSA-Konzentration (erst ab >6 x 10-4 mol/l) entsprechend der Proteinstruktue des BSA-Konformers F. Dabei war die Pufferkapazität von Rinderserumalbumin bei Konzentrationen < 3 x 10-4 M sehr niedrig und quasi Konstant. Tanford et al. (1955) fande, das die Hin- und Rücktitrationskurven von BSA reversibel sind.

Der graphische und rechnerische Pufferbeitrag der Molkenproteine

Aus obigen Informationen ist Schluss zu folgern, dass bei der maximalen Pufferung (β ~0,016 mol/l, pH ~4,4) des »süßen« MF-Permeates im pH Bereich 3,8 – 4,8, in dem die Molkenproteine mit ~0,0045 mol/l (~28 %) beitragen (Tab. 5), ein Anteil auf den Gehalt der zahlreichen Karboxylgruppen der Asp mit pKS~3,5 + 1,2 und Glu mit pKS~4,2 + 0,9 (Pace et al., 2009) anfallen dürfte. Der Beitrag ist jedoch relativ Klein, weil die molare Konzentration an Molkenproteinen und im MF-Permeat recht niedrig ist: ~86,2 x 10-3 mmol αLa, ~83,3 x 10-3 mmol β-Lg, ~5,5 x 10-3 mmol BSA und ~4 x 10-3 mmol Immunoglobuline. Wir haben versucht, den gesamten Beitrag der drei Hauptmolkenproteine graphisch und kalkulatorisch anhand von den publizierten Titrationskurven von Nozaki et al. (1959); Tanford et al. (1955) und Robbins et al. (1967) sowie der vorher angegebenen Molkenproteinkonzentrationen zu erfassen. Dabei haben wir mit einem Diagrammleser die publizierten Graphiken ausgearbeitet und als d[H+]/dpH versus pH dargestellt. Als Beispiel dieses Vorgehens stellt Abb. 8 diese Pufferungskurven (pH Bereich 2 7) von β-Lg, α-La und BSA, nachgearbeitet aus den obigen zitierten Arbeiten dar. Die Pufferungskurve von BSA in Abb. 8 stimmt sehr gut mit der publizierten β f(pH)-Kurve von Curvale (2009) überein und zeigt eine relativ starke Pufferung im pH Bereich 2,0 – 4,0.

Aus den Kurven von β als f(pH) (Abb.8) konnten die folgenden individuellen theoretischen Beiträge der Hauptmolkeproteine zu der Pufferung errechnet werden (Tab. 5). Man solte dabei berücksichtigen, dass die Kurven in Abb. 8 reine individuelle Molkenproteine darstellen, also ohne die gegenseitige Beeinflussung und Interaktionen mit der natürlichen wässrigen Phase. Dabei sind die Immunoglobuline nicht vertreten, da wir Keine Titrationskurven in der wissenschaftlichen Literatur finden Konnten. Wir haben eine Konzentration an (reinen) Molkenproteinen im MF-Permeat als 6,2 gL-1 eingesetzt.         

In Teil 2 wurde vorgeschlagen, dass die Differenz in dB/dpH zwischen dem MF-Permeat und dem UF-Permeat als f(pH) dem Beitrag der Molkenproteine entsprechen muss. Die Differenz bei pH 4,4 errechnet sich aus β ~0,0113 mol/l im UF-Permeat zu dem β-Wert des MF-Permeates (βmax ~0,0158 mol/l) in Abb. 7 als ß~0,0045 mol/L und macht ~28,5 % des maximalen Pufferungspeaks des MF-Permeates aus. Nach Abb. 8 und den angegebenen Konzentrationen Konnten wir bei βmax Einen Molkenproteinbeitrag von 27,7 % (0,00438/0,0158) errechnen. Aus der Differenz zwischen Molke und UF-Permeat in der Arbeit von Walstra & Jeness (1984) lässt sich der Wert ~0,0042 mol L-1 bei pH 4,4 errechnen, was mit unserer graphischen und kalkulatorischen Berechnung sehr gut übereinstimmt (Tab. 5). Der graphisch als auch rechnerisch ermittelte Beitrag von β~0,0045 mol/l ist klein wegen der geringeren Molkenproteinkonzentration in Milch bzw. MF-Permeat. Eine ähnliche graphische Abschätzung des Molkenproteinbeitrages bei pH 5,25 lässt eine Wert von ~0,0026 mol L-1 ab. Für die Pufferungspeaks in dem gesamten pH-Bereich ergaben beide Kalkulationsmethoden ähnliche Durchschnittswerte: 28,1 % (graphisch) bzw. 26,6 % (rechnerisch) für den Molkenproteinbeitrag (Tab. 5). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass mit abnehmendem pH-Wert (6,7 -> 4) die Pufferwirkung der Molkenproteine zunimmt, was aus der Tab. 5 und Abb. 7 und 8 zu entnehmen ist.

Laut Maubois et al. (2001) setzt sich der Molkenproteingehalt idealer Molke aus β-Lactoglobulin (0,31 %), α-Lactalbumin (0,09 %), Bovine Serum Albumin-BSA- (0,09 %), Bovine Serum Albumin-BSA- (0,039 %) und Immunoglobulinen (0,037 %) zusammen (Tabelle 1, Teil 1); darüber hinaus kommt das sog. Glykomakropeptid oder Caseinomakropeptid nicht vor. Recht kleine Mengen (<0,01 % - 0,03 %) an nicht löslichem Protein (Kasein) bei pH 4,6 sind enthalten (Maubois et al., 2001). Lawrence et al. (2008) bestimmten Kaseingehalte zwischen 0,007 % und 0,091 % in Abhängigkeit des transmembranen Drucks. Der NPN-Gehalt (=Nicht Proteinstickstoff, wie zB. Harnstoff, Orotsäure, freien Aminosäuren, Hippursäure, usw.) ist ähnlich wie der in der Kuhmilch (Wolfschoon & Klostemeyer, 1981); dessen Pufferbeitrag dürfte sehr klein sein.

Aus Tabelle 5 ist über den gesamten pH-Bereich ein relativ enger Beitrag der Molkenproteine von ~27 % zur MF-Puffer-ungspeaks ersichtlich. Graphisch (MF - UF) und rechnerisch sind die Werte sehr ähnlich. Mit abnehmendem pH-Wert nimmt der individuelle Beitrag der Molkenproteine der leich zu. Bei pH 6,7 ist die Wirkung der Histidin-Reste der drei Molkenproteine zu merken; BSA, obwohl in geringerer Konzentration vorhanden, hat drei- bis viermal mehr Imidazolgruppen (Tab. 4) als die anderen zwie Proteine. Bei pH 5,25 ist der Beitrag nicht so stark wie bei pH 6,7. Bei dem pH-Wert von 4,4 der pH der maximalen Pufferung (~0,0158 mol/l) des MF-Permeates, tragen die drei Hauptmolkenproteine mit ~0,00438 mol/l zu ~97 % des graphisch ermittelten Wertes von 0,0045 mol/l bei. Der Beitrag der drei Hauptmolkenproteine tritt genau in der Reihenfolge ein, wie derem Konzentration vorkommt: β-Lg > α-La > BSA. Bei pH-Werten unter 4 ist deren Beitrag am stärksten. In Teil 2 konnten wir ermitteln, dass die gesamten Milchsalze, Laktose und Wasser bei pH Wert 4,4 rechnerisch zu ~63,3% (0,0100/0,0158) der βmax beitragen; wenn man diesen Beitrag mit dem der Molkenproteine addiert (0,00438 mol/l) kann man ~91 % der maximalen (MF-)Pufferwirkung bei pH 4,4 erklären. Über den untersuchten pH-Bereich (6,7 → 3,8) ergibt sicht durchschnittlich 95,5 % als Gesamtbeitrag der individuellen Komponenten zu den maximalen Pufferungspeaks im MF-Permeat (Tab. 5). Der rechnerische Beitrag der Molkenproteine zu dem graphischen Beitragswert aus der graphischen Differenz (MF-Permeat – UF-Permeat) bei den Pufferungspeaks im gleichen pH-Bereich (6,7 → 3,8) machte im Durchschnitt 94,5 % aus.

Man kann zusammenfassend aus Teil 1, 2 und 3 folgendes feststellen: im MF-Permeat existieren eine Reihe von Puffersubstanzen, die bei einer pH-Veränderung ihre Wirkung z.T. gleichzeitg und überlappend bzw. nachgeschaltet zeigen. Es werden immer die vorliegenden Anionen protoniert. Bei pH 6,7 wirkt sich stark (~63,5 %) deas Hydrtogenphosphat-System und schwach die Pufferpaare aus dem System Zitronen- (~2,8 %)- und Kohlensäure (~5,4 %). Die Molkenproteine machen sich auch (~25 %) trotz ihrer niedrigen Konzentration bemerkbar. Anders als die Milch zeigt das MF-Permeat eine starke Pufferung bei pH 4,4, wenn mit starker Säure titriert wird. Die Pufferungspeak ist insbesondere auf die Zitronensäure (~57,5 %) und die Molkenproteine (~28 %) zurückzuführen. Phosphate- (~2 %) und Karbonat- (~0,8 %) Spezies tragen kaum zur Wirkung (pH 4,4) bei, Laktose und Wasser ebenfalls wenig ~3 % (Tab. 3 und 5). Wasser puffert stark an beiden Extremen der pH-Skala (van Slyke, 1922). Ein Aspekt, der von uns NPN-Komponenten, in denen bekanntlich protonierbare Bestandteile vorliegen, die in diese Hinsicht noch nicht untersucht worden sind und zur Pufferung recht wenig aber bestimmt beitragen könnten. Aus Tab. 5 ist ersichtlich, dass bei pH-Wert 3,8 der errechnete Beitrag der puffernden Substanzen mehr als 100 % ausmachte. Wir begründen dieses Resultat mit den errechneten stark zunehmenden β-Werten für die Molkenproteine in diesem pH-Bereich, in dem sie meisten titrierbaren Karboxylgruppen haben, was wir auf die verwendeten publizierten Kurven (Siehe die Peaks-Aufschläge in Abb. 8) für die reinen Proteine zurückführen. Zudem wurde die Konzentration an individuellen Molkenproteinen analytisch nicht bestimmt. Darüber hinaus können die verwendeten Dissoziationskonstanten für die Milchsalze auch sicherlich hier eine Rolle gespielt haben.

Im nächsten Abschnitt wird die Pufferung des angesäuerten MF-Permeates untersucht. Bei der Milchsäuregärung entsteht aus der Laktosespaltung Milchsäure, eine schwache Säure, die ein Pufferpaar mit dem Laktat bildet und eine starke Pufferung hat. Ferner wird der Protonierungsgrad des MF-Permeates graphisch dargestellt und diskutiert. Letztlich wird auf die graphische und theorestiche Wirkung des Kaseins, der Milchsalze und der Molkenproteine bei der Pufferung von Magermilch eigegangen. Teil IV erscheint in der nächsten Ausgabe.

 [117] WOLFSCHOON-POMBO, A. F.; RIBEIRO, D. W. Die Pufferungskurve von idealer Molke (MF-Permeat) – Teil III. DMZ, v. 24, p. 16-19, 2014.