Die Pufferungskurve von idealer Molke (MF-Permeat) – Teil IV

Serie: Pufferung der Milchsäure, Protonierungsgrad um individuelle Pufferwirkun in Milch.  

In Teil 1-3 wurde die Pufferungskurve von idealer Molke dargestellt und anhand deren puffernden, Bestandteille (Milchsalze, Molkenproteine, Laktose und Wasser) die individuelle Wirikung bei den Pufferungspeaks im pH-Bereich 6,7 → 3,8 erläutert. Im letzten Teil dieser Reihe wird die Pufferwirkung des Milchsäure/Laktat-Systems anhand angesäuerter Mikro- und Ultrafiltrationspermeate sowie Sauermolke beschrieben. Zudem wird die gesamte Protonierungskurve des MF-Permeates erläutert. Eine Übertragung der Wirkung der individuellen Bestandteile auf die Gesamtpufferung von Milch wird abschließend gemacht und der Kaseinbeitrag dadurch graphisch und kalkulatorisch dargestellt.

Pufferung der Milchsäure / Laktat

Die Säuerung der Milch ist ein wichtiger Prozessschritt bei der Herstellung von fermentierten Milchpeodukten, sauren Kasein und Käse. Dabei nimmt die Milchsäure (Laktat-H+) einen bedeutenden Platz ein, denn sie bringt weitgehende organoleptische und chemisch-physikalische Veränderungen mit sich. Die folgende Abbildung gibt die Molenbruchverteilung von Milchsäure und Laktat sowie des errechneten β-Wertes im pH-Intervall 1,0 – 7,0 wieder bei einer molaren Konzentration von 72,2mmol L-1 (~0,65% Milchsäure).

Nach dem Massenwirkungsgesetz wird durch die starke Erhöhung der Laktat-Ionenkonzentration das Gleichgewicht der Reaktion Milchsäure (Laktat- H+) + H2O (símbolo) H3O+ + Laktat- nach links in Richtung der undissoziierten Milchsäure verschoben, was mehr Säureprotonen im Vergleich zu einer starken Säure benötigt, um eine pH-Einheit zu überwinden; dadruch wird eine Abstumpfung hervorgerufen (Kirchmeier, 1980). Bei der biologischen Gärung mit heterofermentativen Bakterien wird gleichzeitg Zitrat abgebaut und auch andere Stoffwechselprodukte gebildet, die die Pufferung beeinflusen.

Pufferungskurve des angesäuerten MF-Permeates

Als Ausgangstoffe dienten MF- und UF-Permeate, derem Pufferungskurven in Teil 1 und 2 veröffentlicht wurden. Wenn diese MF- und UF-Permeat mit Milchsäurebakterien versetz und bei Raumtemperatur angesäuert wurden, fiel der pH-Wert von ~6,6 bis auf ~4,5 ab. Als Resultat des Laktosestoffwechsels durch die eingesetzte Bakterien entstand Milchsäure, die weiter ihre maximale Wirkung als Milchsäure/Laktat-Pufferpaar bei pH = pKS ~3,86 ausweist.

Abbildung 10 zeigt die Hin- und Rücktitrationskurve des angesäuerten MF- um UF-Permeates im Vergleich mit denselben nicht-angesäuerten MF- um UF-Permeaten sowie mit Sauermolke der Frischkäseherstellung. Daraus ist die zunehmende potente Pufferwirkung des Puffersystems Milchsäure/Laktat deutlichersitlich, die sogar die Pufferwirkung der Milchsalze (im UF-Permeat) bzw. Milchsalze + Molkenprotein (im MF-Permeat) im pH-Bereich ~3,8 - 4,8 mit β ~0,010 mol/L (pH 3,9) auf β ~0,028 mol/L (im UF-Permeat) bzw. von ~0,014 mol/L auf β ~0,035 mol/L (im MF-Permeat) bei pH 3,9 verschiebt und die erste Pufferung ˶überschreibt”. Dieser Effekt ist in dem angesäuerten MF-Permeat wegen dessen Molkenproteingehalt und insbesondere in der sauren Molke (β ~0,058 mol/L) wegen der zusätzlichen Pufferung des gelösten CCP (= kolloidales Kalziumphosphat) aus geprägter. Ferner ist aus Abb. 10zu entnehmen, dass keine ausgeprägte Bildung von Phosphatsalzen (Rice et al., 2010; Wiley, 1935b) in dem angesäuren UF-Permeat bei pH-Werten >6 bis 7,0 aufgetreten ist. Das zeigt die Rücktitrationskurve mit Lauge deutlich. Diese Beobachtung ist durch das fehlende gelöste CCP der Kaseine (Kirchmeier, 1977) in dem UF-Permeat und auf die Assoziation von Kalzium mit Laktat (und eventuell vorhandenes Zitrat) zu begründen. Dagegen ist die Insolubilisierung von Phosphatsalzen in der Sauermolke (sowie in Milch, Abb.1, Teil 1), die CCP enthält, bei der Rücktitration sehr stark und im süßen MF-Permeat nur leicht bemerkbar. Durchfiltrierte Kaseine (<0,03%) bei der Mikrofiltration können hier auch eine Rolle spielen. Bei der Herstellung von Frischkäse wird das mizellare Kalziumphosphat aus den Kaseinen durch Protonierung gelöst und geht in die wässrige Phase über (Kirchmeier, 1977; Wolfschoon & Andlinger, 2013). Die Titrationskurve der sauren Molke, die aus geronnener Milch durch Milchsäuregärung (oder Fällung mit Säure) gewonnen wurde, zeigt deutlich diese Pufferung (Abb. 10). Die Rücktitrationskurve einer Molke aus Labfällung (pH >>6,3), bei der kolloidales Kalziumphosphat (CCP) fehlt (siehe z.B. Kirchmeier, 1980 und 1977; Whittier, 1929; Wiley, 1935b) hat dies dagegen nicht. Der Pfeil (5) in Abb. 10 zeigt die zusätzliche Pufferung des CCP. Die Pufferwirkung des Zitrates im pH-Bereich dessen 2. und 3. pKS ist sicherlich reduziert, da Zitrat durch die eingesetzten Bakterien vergoren wird.

Die Differenz in der Pufferintensität zwischen angesäuerten MF-Permeat und fermentierten UF-Permeat liegt darin, dass in Ersterem viel mehr Milchsäure gebildet werden muss, um die Pufferbarriere der Molkenproteine bei der Milchfermentation zu überwinden; das ist aus Abb. 10 ersichtlich (3 4). In der Salz(Anionen)- Zusammensetzung ist die wässrige Phase beider Permeate nahezu vergleichbar. Hill et al. (1985) fanden bei der Titrationskurve von Mozzarella-, Cheddar- uns Hüttenkäsemolke in Übereinstimmung mit Abb. 10, dass die maximale Pufferung im pH-Bereich 3,2 – 4,0 auf das Laktatsystem bzw. bei pH 5,6 – 7,0 auf die Phosphat-Pufferpaare zurückzuführen ist.

Bei angesäuerten Permeat und Molke läuft die Pufferung wie folgt: das System Milchsäure/Laktat kann nur bei der Milchsäuregärung agieren und wirkt sich stetig und langsam mit fortschreitender pH-Absenkung satrk aus; es verschiebt sogar das Maximun von pH ~4,4 auf pH ~3,8-3,9, ein pH-Wert, der im pH-Bereich der Dissoziation dieses Pufferpaares (und gleichzeitig im pH-Bereich der Karboxylgruppen der Molkenproteine, Tab. 4) steht. Die Milchsäure wird erst im Laufe der biologischen Säuerung gebildet und muss sämtliche Puffersysteme der Milch (Roeder, 1954; Kirchmeier, 1980; Töple, 2007) durchlaufen. Dabei werden dauernd neue Laktat-Ionen gebildet, wie die folgende mögliche Reaktionen aufzeigen:

  Histidylreste-Imidazol-NH + Laktat-H+

  → Histidylreste-Imidazol-NH2+ + Laktat-

  HPO4-2 + Laktat-H+

  → H2PO4- + Laktat-

  HZitrat-2 + Laktat-H+

  → H2Zitrat- + Laktat-

  Molkenproteine-RCOO- + Laktat-H+

  → Molkenproteine-RCOOH + Laktat-

Alle obigen Reaktionen finden wahrscheinlich je nach Milieu in unterschiedlichem Maß statt. Auch wenn Kistidin und Bikarbonat in recht geringeren Konzentrationen vorkommen, werden ihre protonierbaren Gruppen zunächst titriert.

Der Protonierungsgrad (Abb. 11) ist definiert als das Konzentrationsverhältnis [HA]/([HA]+[A-] = KS, das nicht zu verwechseln ist mit dem Protolysengrad oder Dissoziationsgrad α (Kirchmeier, 1977b und 1980). Der Protonierungsgrad drückt das Verhältnis zwischen der Molzahl gebundener Protonen und der Molzahl der Protonierungspartner (Neumann, 1973) aus. Er gibt an, bei welchem pH-Wert ein Puffersystem aufgefüllt ist und nimmt kontinuierlich mit der Zufuhr von Protonen zu (Kirchmeier, 1980). Abb. 11 zeigt, an welcher Stelle der scheinbare pkS aller Puffersysteme sich im Gleichgewiicht mit den [H+] befindet. In einem System (MF-Permeat), das mehrere Pufferpaare enthält, ruft die Zugabe von Protonen einen ständigen Wechsel in der [H+]-Verteillung zwischen den verschiedenen Pufferpaaren in Abhängigkeit von deren Konzentration und Gleichgewichtskonstanten hervor. Alle Hauppufferpaare, die in dem süßen neutralen MF-Permeat (pH ~6,7) bis in dem angesäuerten MF-Permeat agieren, wurden vorher (Teil 1 – 3) beschrieben. Aus der eingeschlossenen Fläche der Hysreresisschleife (Abb. 11) ist der Verlust an freier Energie und die Entropieproduktion experimentell bestimmbar (Kirchmeier, 1977).

Nach Tanford & Roxby (1972) ist der Effekt von Gruppenladungsinteraktionen auf die Dissoziationskonstante einer bestimmten Gruppe i durch die Interaktion von allen anderen Ladungen mit der Ladung des betroffenen Pufferpaares i bestimmt; weiterhin, dass der Effekt von einer positiven Ladung auf Gruppe j immer eine Verschiebung des pKS zu einem niedrigen Wert ist. Kirchmeier (1980) schreibt: ˶alle Systeme stehen untereinander im Gleichgewicht durch den Zusammenhang pH =  pKS1 + log (1 – α1)/α1 = pK2 + log (1 – α2)/α12 = pKsn + log (1 – αn)/ αn, wobei 1, 2, n die einzelnen Pufferysteme sind, d.h. bei einem gegebenen pH-Wert stellen sich alle Puffersysteme auf einen bestimmten Protonierungsgrad α ein.” Im Fall des MF-Permeates scheint dieses Gleichgewicht bei pH ~4,42 zu liegen (Abb. 11).

Theoretischer Beitrag der puffernden Komponenten in Milch

Wir haben auf eine sehr einfache graphische Weise den Beitrag der Milchkomponenten zur Pufferung in MF- und UF-Permeat dargestellt und berechnet. Dabei haben wir eigene Titrationskurven für Magermilch, MF- und UF-Permeat erstellt und somit die Hauptfraktionen zinächst graphisch differenziert: Milchsalze (mehrbasischen Säuren), Laktose und Wasser im UF-Permeat; MF-Permeat minus UF-Permeat ergibt die Molkenproteine, und nun Kasein als die graphische Differenz von Milch minus MF-Permeat. Für die Laktose wurde eine Lösung hergestellt (wir hatten nicht das NF-Permeat zur Verfügung). Andererseits haben wir graphisch und rechnerisch anhand von publizierten Titrationskurven von Molkenproteinen den Beitrag von α-Laktalbumin, β-Laktoglobulin und BSA (Rinderserumalbumin) ermittelt. Dabei konnten wir nicht die gegenseitigen Interaktionen der reinen Proteinkurven berücksichtigen, was eine formale Überschätzung deren einzelnen Beiträge be deutet. Andere Autoren (Kirchmeier, 1980; Srilaorkul et al., 1989; Lucey et al. 1993) verwendeten indirekte Methoden (chemische Trennung, Ausfällung, Dialyse von Komponenten, Einlabung, Abwägung vonPapierflächen, Gefriertrocknen, usw.), um den Beitrag zu ermitteln. Alle diese Methoden ˶verletzen” die Integrität des Milchsystems; die ist nicht der Fall mit der von uns vorgeschlagenen Methodik. Die folgende Tabelle 6 gibt zusammenfassend die Umrechnung unserer Ergebnisse auf die Pufferung der individuellen Bestandteile von Magermilch für bestimmte pH-Werte (Pufferungspeaks) wieder. Abb. 12 stellt den Beitrag dieser Komponenten zur Pufferwirkung in Milch dar.

Die Tabelle 6 und Abb. 12 zeigen deutlich, dass die Beiträge der verschiedenen Komponenten sich laufend mit der pH-Absenkung verändern. Daraus folgt, dass man nicht im Allgemeinen über den Beitrag von Komponenten zur Pufferung reden kann, ohne den pH-Wert oder das pH-Intervall zu benennen. Über den gesamten pH-Bereich von 6,7 bis 3,8, machen die Milchsalze + Laktose + Wasser (also UF-Permeat) im Durchschnitt (graphisch) ~36,8% der Milchpuggerung (nicht der Pufferungspeaks!) aus; dieser Wert erhöht sich auf 51%, wenn man den Beitrag des MF-Permeates (also zusätzlich der Molkenproteinwirkung) berücksichtigt. Der Unterschied zwischen beiden Werten, 51% (MF) – 36,8% (UF), also 14,2%, ist auf die Molkenproteine zurückzuführen. Lucey et al. (1993) fanden 46,4% für den Beitrag von Labmolke (also Milchsalze + Molkenproteine) zur Milchpufferung.

In Labmolke ist zusätzlich Glykomakropeptid vorhanden, das auch zur Pufferung beitragen könnte. Andere Autoren fanden einen Molkenproteinbeitrag von 8,3¨bzw. 5,4% für den pH-Bereich von 7 → 4,5 (Kirchmeier, 1980) bzw. 7 → 4,6 (Srilaorkul et al., 1989). Wir errechneten 11,6% für den ph-Bereich 6,7 → 4,6.

In der erwähnten Literatur findet man Angaben für die Milchsalze von 65,1% bis 58,6% (pH-Bereich 7 → 4,6 bzw. 4,5), viel höher im Vergleichzu unserem Wert (~32%. pH-Berecih 6,7 → 4,6). Der Grund für den Unterschied liegt darin, dass die Milchsalze in dem Filtrat der Säurefällung des Kaseins bestimmt wurden und somit kolloidales Kalziumphosphat (CCP) enthalten ist. Lucey et al. (1993) ermittelten den Beitrag des CCP zum Pufferungsvermögen von Milch (pH 6,7) als 20,9%, ein Wert, der wenn addiert zu 35,6% (Milchsalze nach unserer Methode für den pH-Bereich 6,7 → 3,8) 56,5% ergibt, im Einklang mit den obigen Literaturangaben.

Der Beitrag des Kaseins (einschließlich CCP; pH-Bereich von 6.7 bis 3,8) ergibt sich als 49% aus der Differenz Magermilch minus MF-PermeT, ALSO 100% – 51%. Dieser Wert (49%) ist höher als die Werte der Literatur (26,3% – 36%) und ist ewartungsgemäß am Größten (um ~70%) bei pH 5,25 (Tab. 6, Abb. 12), der pH-Wertbei dem die meisten publizierten Pufferrungskurven von Milch das Maximum zeigen. Das CCP ist dafür mitverantwortlich, denn die Pufferungskurve wurde aus Magermilch und nicht aus Säurekasein bestimmt. Aus Titrationskurven (Milch minus HCI-Molke) von Whittier (1929) haben wir Einen Kaseinbeitrag von ~62% bei pH 5,25 in der Milch errechnet. Der starke Wirkungsbereich der Kaseine (Abb. 12) steht im Einklang mit den Angaben von Kirchmeier (1977; 1980) bzw. Wiley (1935a, b), der ˶Hammarsten˝-Kasein in Anwesenheit von Milchsalze sowie Lab und saure Molke titriert hat. Salaün et al. (2007) bestimmten die Pufferungskurve einer Kaseinmizellensuspension, die sehr gut mit der von uns dargestellten (Einblendung in Abb. 12) Kurve übereinstimmt. Aus dieser Arbeit errechneten wir Einen Kaseinbeitrag von 71,4%bei pH ~5,25 zur Milchpufferung. Ferner stellten Salaün et al. (2007) und andere Autoren (Wiley, 1935a, b; Whittier, 1929) fest, dass die Zugabe von Kalzium, Natriumzitrat und Natriumphosphat die Milch- und Kaseinpufferung in bestimmten pH-Bereichen unterschiedlich beeinflusst. Tabe. 6 zeigt, dass die Milchsalze (hauptsächlich die Säuren) in etwa die gesamte Pufferung des UF-Permeates erklären. Dasselbe gilt für die Molkenproteine + Milchsalze + Laktose + Wasser im Verhältnis zu der MF-Pufferung. Aus Tab. 6 kann mehrbasischen Säuren sowie der drei Hauptmolkenproteine entnehmen.

Wir sollten bei den hier präsentierten Ergebnissen berücksichtigen, dass bei der rechnerischen Datenbearbeitung von publizierten Konzentrationen und Dissoziationskonstanten ausgegangen wurde und dass die verschiedenen Assoziationen der Anionen mit Kationen nicht berücksichtigt wurden. Eine genauere Kalkulation wäre erst möglich, wenn man u.a. die tatsächlich vorhandenen Konzentrationen (z.B. Zitronensäure-, Milchsäure-, Karbonsäure-, Molkenproteingehalt, mit Kalzium, Magnesium, usw.) in den Flüssigkeiten bestimmen würde,

Schlussfolgerung 

Die Nachbildung der Pufferungskurvevon MF-Permeat und Milch durch Addition der Kurve der individuellen beitragenden Komponenten klingt logisch, aber nicht vollständing machbar. Dies wüde voraussetzen, dass man genaue Kenntnisse über die intrinsische und scheinbare Dissoziationskonstanten der verschiedenen Pufferscharen hat. Außerdem müsste man Informationen über deren Beeinflussung in dem vorhandenen Puffersystem und deren gegenseitigen Interaktionen haben. Wie schon Roeder (1954) schrieb: ˶Für jeden pH-Wert muss innerhalb der in Frage kommenden Säure-Salz Paare ein ganz bestimmtes Verhältnis [Säure]/[Salz] bestehen und dementsprechend stellt sich in dem ganzen System ein Gleichgewichtszustand ein, der darduch gekennzeichnet ist, dass K1 = [Säure1] / [Salz1] = K2 =[Säure2]/[Salz2] = K3 [Säure3] usw.ist˝. Deswegen es ist nur möglich, von scheinbaren Dissoziationskonstanten und Gleichgewichten bzw. von theoretischen errechneten Methode, die Titration der verschiedenen durch Filtration fraktionierten Milchbestandteile und graphische Analyse, erwies sich als vielversprechend. Wir konnten ein rechnerisch die praktisch ermittelten Pufferungsmaxima (βmax) in Milch sehr gut (98%) belegen. Für das MF-Permeates Maximum bei pH ~4,4 (anders als bei der ursprünglichen Milch bei ~5,25), der pH-Wert in dem nach der Protonierungskurve das System im Gleichgewicht steht. Daraus ergibt sich die Rangfolge der puffernden Substanzen in Milch im pH-Bereich 6,7 → 3,8: Kaseine+CCP (49%) > Milchsalze+Laktose (36,8%) > Molkenproteine (14,2%).                  

Das Literaturverzeichnis kann in der Redaktion angefordert werden.

[118] WOLFSCHOON-POMBO, A. F.; RIBEIRO, D. W. Die pufferungskurve von idealer molke (MF-Permeat) – Teil IV. DMZ, v. 25, p. 18-22, 2014

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